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CRISPR/Cas9基因敲除/敲入技术

来源: 本站原创    作者:佚名   发布时间:2015/4/7 10:46:03

 

服务描述

制作原理

       CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。 CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中,crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA,此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑, 目前已经成功应用于大小鼠基因的KO/KI模型制备。

 

服务流程和周期

 

 

 

CRISPR/Cas9流程图

      Cas9结合gRNA,gRNA 的长度约为80个核苷酸,包含两个区域:gRNA 5' 端前20个核苷酸对应于靶标DNA,能 结合在靶DNA 上的约60个核苷酸(gRNA 长度取决于表达gRNA 的质粒)形成一个发夹结构,这个结构能帮助 gRNA 与Cas9结合,并由此指导与DNA 的结合。
通过gRNA上的靶点序列,在目标基因组上找到靶点序列,并揭开双螺旋,Cas9将剪切DNA双链,造成DNA双链断裂。Cas9使用简单,可满足多个靶点同时操作。

 

 

CRISPR/Cas9技术特点

1、可实现对靶基因多个位点或多个基因同时敲除;

2、实验周期短,价格低;

3、可应用于大、小鼠等,无物种限制。

 

服务类型

1、全身性基因敲除

2、点突变

3、小片段基因敲入

4、双/多基因敲除

 

建系原则与流程

1、CRISPR/Cas9技术获得的基因敲除鼠,由于是在大鼠或者小鼠的鼠原核受精卵期进行的修饰,获得的F0鼠一般也是杂合子,并且每只FO鼠由于移码突变情况可能不一样,所以每只F0鼠也需要作为一个独立的谱系进行传代;

2、原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠,F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠(可能有多种突变类型的F1);

3、选择来自同一只F0代鼠,突变类型一致的F1代鼠,达到性成熟后与进行同胞交配,可获得F2代鼠。对交配获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上, F2代鼠中25%为相同突变型的纯合子鼠,有50%为只有一条染色体突变的杂合子鼠,有25%为野生型鼠。

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